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　miR-21とmiR-31は癌抑制遺伝子を負に制御するmicroRNA（miRNA）で、様々なヒト腫瘍で認められる。大腸癌組織ではmiR-21発現が増強されており、化学療法抵抗性や生命予後に関係することが知られている。miR-31も大腸癌組織での過剰発現がみられ、腫瘍の成長に関係するとされている。miR-21あるいはmiR-31は、大腸前癌病変である腺腫においても過剰発現していることが多い。これらの背景より、この2つのmiRNAは大腸癌早期診断あるいは予後予測のためのマーカーとして有用であるという仮説を立て、screening phaseとvalidation phaseの 2段階方式で試験を行った。
　screening phaseでは、細胞株を用いた検討および、12例の大腸癌患者および年齢、性別が合致する12例の健常者をコントロールとした血中miRNAの測定を行った。validation phaseでは別コホートの大腸癌患者186例、術後患者60例（根治的切除術45例、原発巣切除術15例）、進行大腸腺腫患者43例、健常対照群53例において検証を行った。そして大腸癌の早期発見と病勢進行に関するmiR-21とmiR-31の血中バイオマーカーとしての臨床的意義を検討した。
　まず、大腸癌細胞株HCT116あるいはSW620を培養し、培養上清中のmiR-21を測定したところ、どちらの株においても経時的な発現上昇が認められ（24時間、48時間それぞれのp＜0.05）、miR-21は分泌型miRNAであることが示唆された。一方、miR-31の培養上清中発現量には有意差はなかった。
　次に、8つの大腸癌組織と隣接する正常粘膜とでmiR-21およびmiR-31の発現量を比較すると、両miRNAとも大腸癌組織で有意に発現量が上昇していた。しかしながら、血清中miRNAの測定結果（大腸癌患者12例、健常対照群12例）では、24時間の循環miR-21発現量は大腸癌群で有意に上昇していた（p＜0.001）が、miR-31の発現には有意差はみられなかった。
　これらの結果からmiR-21のみが分泌型であると考えられ、以降の解析はmiR-21に絞って行うこととした。
　第2段階における大腸癌群186例（平均年齢67±7.5歳）、腺腫群43例（同66±9.8歳）、健常対照群53例（同64±12.9歳）の背景因子に有意差はなかった。追跡期間の中央値は44ヵ月である。
　大腸癌群、腺腫群、健常対照群、計282例の血清を解析したところ、miR-21濃度は健常対照群に比べて大腸癌群、腺腫群で上昇していた（ともにP＜0.001）。大腸癌群ではとくにTNM分類�W期の患者でI期／II期に比べて高濃度であった（どちらもP＜0.05）。
　ROC（receiver operating characteristic）解析を行ったところ、血清miR-21濃度は大腸癌と対照（AUC＝0.927、感度82.8%、特異度90.6%）、あるいは大腸腺腫と対照（AUC＝0.803、感度76.8%、特異度81.1%）の識別に有用であった。さらに、BCa（bias correction and accelerated）ブーストラップ法にて検証したところ、ROC法で求められたAUCとBCaブーストラップ法で求められたAUCはほぼ合致した。また、ROCCH（ROC convex hull）による解析では、大腸癌ではオリジナルのAUC＝0.838、BCaブーストラップによるAUC＝0.813、大腸腺腫ではそれぞれ0.935、0.919で有意差はなく、血清miR-21が大腸腫瘍のバイオマーカーとして有用であることが示唆された。
　次に、大腸癌患者におけるmiR-21の特性を、組織標本とそれにマッチする血清とで調べた。患者の臨床病理的背景との関連では、組織での高発現と血清での高濃度の両方がみられたのは腫瘍径の大きい患者（組織 p＝0.01、血清 p＝0.004）、遠隔転移のある患者（p＝0.02、p＝0.01）であり、組織におけるmiR-21発現量は病期進行との間に関連がみられた（I期 vs IV期、II期 vs IV期のP値はそれぞれp＜0.05）。また原発腫瘍のmiR-21発現量は、マッチする血清中のmiR-21濃度と正の相関関係を示した。
　手術前後における血清miR-21濃度は術前に比べ術後に有意に低下していた（60例、p＜0.001）。根治的切除術を受けた45例では術後のmiR-21値は有意に改善していたが（p＜0.001）、原発巣のみの切除15例では有意差はなかった（p＝0.72）。
　最後に、組織および血清中miR-21レベルと予後との相関を解析した。組織中miR-21発現量が高い（＞3.7）群のOSは有意に不良であり（p＝0.006）、同様に血清中miR-21濃度が高濃度の群（＞0.0031）はOSが不良であった（p＝0.005）。Cox比例ハザード回帰解析を行ったところ、単変量解析ではmiR-21の組織高発現（p＝0.01）、血清高濃度（p＝0.003）、遠隔転移あり（p＜0.001）がOS不良因子であった。多変量解析では、血清miR-21高濃度（HR 4.12、95%CI 1.10-15.4、p＝0.03）および遠隔転移（p＜0.001）がOS不良の独立した因子であった。
　以上より、miR-21は大腸腫瘍に高発現する分泌型miRNAであり、血清中miR-21は大腸癌、大腸腺腫に対する早期診断あるいは予後予測のための非侵襲的バイオマーカーとなりうると考えられた。

　microRNA（miRNA）は血清中で安定であり、バイオマーカーとしての研究報告が複数おこなわれているが、その診断・予後マーカーとしての役割を十分に検証している研究は少ない。本研究は、screening phaseとvalidation phaseの2段階の検証を用いて、miR-21のバイオマーカーとしての意義を検討したものである。2012年に米国ルイビル大学のグループより、大腸癌患者の血清中miR-21が診断マーカーとしての検証が40例（大腸癌20例、matched control 20例）に対して行われているが、本研究はその報告を受けて、validation phaseで186症例（大腸癌60例、大腸腺腫43例、コントロール症例53例）の検討を行っている。
　結果は、大腸癌あるいは大腸腺腫患者の識別（対健常者）、予後との相関が示され、さらに、臨床病期との相関、手術による血清中レベルの低下、大腸癌組織中及び血清中のmiR-21レベルの相関なども示さている。極めて有望な結果であると思われるが、実際の検査対象となる母集団は本研究の解析対象とは有病率が著しく異なると思われ、診断のバイオマーカーとしての評価は今後の前向き研究を待つ必要がある。また、大腸腺腫の症例に対しては「advanced adenoma」という説明が付されているものの、その定義が明確に記載されていない。腫瘍経あるいは組織学的異型度による定義であろうと思われるが、血中miR-21が大腸癌だけでなく腺腫の患者を区別し得るマーカーであるという結果であるので、腺腫の定義のされ方が気になるところである。

監訳・コメント：慶應義塾大学医学部　樋口 肇（講師）